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耀杰不凡丨第一刊：ddPCR比拼RT-PCR，探最精準(zhǔn)新冠載量變化
疫情之下，逆行者最美，守護(hù)人民健康，貢獻(xiàn)智慧與光芒，國(guó)內(nèi)首批獲證新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒知名生產(chǎn)廠家伯杰醫(yī)療特發(fā)起《“耀杰不凡”——致敬幕后抗疫英雄系列》學(xué)術(shù)專題活動(dòng)。
“耀杰不凡”致敬幕后抗疫英雄推文解讀活動(dòng)
第一刊：ddPCR比拼RT-PCR，探最精準(zhǔn)新冠載量變化
疫情之下，逆行者最美，守護(hù)人民健康，貢獻(xiàn)智慧與光芒，國(guó)內(nèi)首批獲證新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒知名生產(chǎn)廠家伯杰醫(yī)療特發(fā)起《“耀杰不凡”——致敬幕后抗疫英雄系列》學(xué)術(shù)專題活動(dòng)。旨在傳播、分享疫情期間一線檢驗(yàn)及臨床工作者相關(guān)研究成果，經(jīng)過論文征集及篩查，最終確定病毒載量、婦兒感染、混合感染、病毒結(jié)構(gòu)、樣本差異、輸入防控、出院復(fù)陽(yáng)、試劑盒優(yōu)劣等8期內(nèi)容進(jìn)行分享。
本期研究由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院張福杰教授團(tuán)隊(duì)基于清華大學(xué)郭永研究員團(tuán)隊(duì)的微液滴數(shù)字PCR（ddPCR）研究完成，通過對(duì)比ddPCR和RT-PCR技術(shù)在新冠患者疾病進(jìn)展中病毒載量的變化，發(fā)現(xiàn)并證明了使用RT-PCR和ddPCR定量檢測(cè)下的病毒載量對(duì)于評(píng)估疾病的進(jìn)展有積極作用，而在病毒載量低的情況下，其優(yōu)勢(shì)更是顯著。
本期作者團(tuán)隊(duì)之一來(lái)自北京地壇醫(yī)院，他們?cè)谡麄€(gè)疫情期間，救治了大量的新冠患者，在北京防疫期間承擔(dān)著非常重要的工作，而這項(xiàng)研究成果也誕生在這個(gè)時(shí)期。
研究共納入了127例患者的400個(gè)樣本，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院張福杰教授團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)郭永研究員團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)之初，為了達(dá)到更好的對(duì)比評(píng)估效果，不僅使用RT-PCR和ddPCR同時(shí)去檢測(cè)標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)所招募的127名受試者也既包括確診病例54例、疑似病例39例，同時(shí)又納入了34例因發(fā)燒或呼吸道癥狀接收篩查但不符合可疑病例診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者?；颊甙ǎ壕哂?次接觸史及2種臨床情況；無(wú)明確的接觸史，但符合3種臨床情況。（臨床情況包含：發(fā)燒和/或呼吸道癥狀，病毒性肺炎的影像學(xué)特征，發(fā)病初期較早的白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；虻?，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少）
圖1. 項(xiàng)目檢測(cè)參與者構(gòu)成圖
SARS-CoV-2檢測(cè)：
本次研究所涉及的樣本類型較為全面，包括了口咽拭子，鼻咽拭子，痰液，血液和尿液樣本，統(tǒng)一采用專業(yè)的核酸提取試劑盒在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成核酸提取，然后再進(jìn)行RT-PCR和ddPCR檢測(cè)。
其中RT-PCR檢測(cè)使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司的反應(yīng)和擴(kuò)增系統(tǒng)，對(duì)靶向ORF1ab和N基因以及陽(yáng)性參考的引物和探針進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄PCR。
檢測(cè)結(jié)果：
數(shù)據(jù)分析：通過RT-PCR和ddPCR兩種方法的檢測(cè)，34例篩查病例和17例可疑病例的77份標(biāo)本結(jié)果均呈陰性。從患者年齡上看，中位年齡為40歲，男性比例為50％；入院時(shí)最常見的體征和癥狀是發(fā)燒和咳嗽。
從病程進(jìn)展看，77.6％的患者為輕度類型，而22.4％的患者為較嚴(yán)重類型。從臨床階段而言，有49例患者處于恢復(fù)階段，所占比例最大，其次是進(jìn)行性階段，早期階段和臨床治愈階段。7名患者的胸部影像學(xué)正常，因此處于不確定的階段。從癥狀發(fā)作到發(fā)病初期，進(jìn)展階段和恢復(fù)階段的平均天數(shù)分別為疾病發(fā)作后的4天，12天和20天。
圖2. 最終確診患者的癥狀
兩種檢測(cè)方法對(duì)另外76名確診患者的323個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果則顯示：根據(jù)RT-PCR結(jié)果，95例陽(yáng)性，67例單基因陽(yáng)性，161例陰性。95例陽(yáng)性的ddPCR結(jié)果也均為陽(yáng)性，RT-PCR的Ct值與病毒載量高度相關(guān)。在67個(gè)單基因陽(yáng)性樣品中，ddPCR陰性的有26個(gè)，陽(yáng)性的有41個(gè)陽(yáng)性，拷貝數(shù)范圍為11.1至123.2拷貝/測(cè)試。
剩余161個(gè)RT-PCR陰性樣本中，有157個(gè)樣本的ddPCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，4個(gè)樣本陽(yáng)性。結(jié)果表明，RT-PCR和ddPCR在高病毒載量樣品和陰性樣品中均準(zhǔn)確可靠。然后，我們進(jìn)一步比較了3個(gè)呼吸道樣本中的病毒載量。痰液中的平均病毒載量（17429±6920拷貝/測(cè)試）顯著高于口咽拭子和鼻咽拭子。
圖3. RT-PCR和ddPCR的樣本結(jié)果
此次研究表明，RT-PCR和ddPCR對(duì)高病毒載量樣品給出了一致的結(jié)果。不同樣本類型的病毒載量顯示，痰液樣本中的病毒比口咽拭子和鼻咽拭子要多。痰液樣本的定量結(jié)果與最近報(bào)道的研究一致：病毒載量在早期和進(jìn)行性階段呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而在恢復(fù)階段則出現(xiàn)下降。恢復(fù)的患者可能會(huì)出現(xiàn)間歇性病毒脫落，導(dǎo)致核酸結(jié)果再次呈陽(yáng)性。隨著時(shí)間的流逝，大量患者將進(jìn)入康復(fù)階段并出院，對(duì)低病毒載量的監(jiān)測(cè)將更加頻繁。下呼吸道樣品的多次測(cè)試以及通過不同方法進(jìn)行的測(cè)試會(huì)很有助于提高敏感性并評(píng)估是否符合出院標(biāo)準(zhǔn)。
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上海伯杰醫(yī)療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應(yīng)用，深耕于多重?zé)晒釶CR診斷試劑和痕量病毒二代測(cè)序試劑及相關(guān)服務(wù)的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線，從診斷試劑、診斷儀器、測(cè)序服務(wù)和醫(yī)檢所服務(wù)等多個(gè)面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng)新，質(zhì)量為先”的方針，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控公衛(wèi)、高?？蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。
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