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迪拜世博會丨大咖解讀下一代分子診斷技術(shù):CRISPR/Cas系統(tǒng)

理想的病原體核酸檢測方式應(yīng)該是準(zhǔn)確、靈敏、快速、廉價、便攜,并且能在各種環(huán)境下對任何病原體進(jìn)行檢測。

2022-04-08
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導(dǎo)語

理想的病原體核酸檢測方式應(yīng)該是準(zhǔn)確、靈敏、快速、廉價、便攜,并且能在各種環(huán)境下對任何病原體進(jìn)行檢測。近年來,基于成簇間隔的短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)的新型分子診斷工具,似乎具有成為這樣理想化核酸檢測平臺的潛力。

01
下一代分子診斷技術(shù)!

從1987年首次發(fā)現(xiàn)CRISPR, 到最近幾年CRISPR-associated(Cas)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,以及2020年的諾貝爾化學(xué)獎頒給了CRISPR的發(fā)現(xiàn)者,CRISPR技術(shù)被譽(yù)為會改變和造福人類的發(fā)明。短短幾年時間,CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門內(nèi)容,被稱為下一代分子診斷技術(shù)!

2020諾貝爾化學(xué)獎得主:

Emmanuelle Charpentier教授、Jennifer Doudna教授


而關(guān)于CRISPR技術(shù)在臨床領(lǐng)域及新冠檢測方面的應(yīng)用,也成為了近期的討論熱點(diǎn)。中國科學(xué)院趙國屏院士、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胡必杰主任在2020迪拜世博會中國館上海日《走近伯杰, 了解新冠抗疫中國方案、中國速度》專題直播中,圍繞著新冠核酸快速檢測技術(shù),帶來了關(guān)于CRISPR技術(shù)干貨滿滿的分享與討論。

02
從新冠核酸檢測說開去

在專題講座《速度為先 | 新冠核酸快速檢測技術(shù)的應(yīng)用及展望》中,胡必杰教授提出對于現(xiàn)在新型冠狀病毒,國家提到了快速檢測,上海市自10月28日起,全市首批21家二級以上綜合性醫(yī)療機(jī)構(gòu)面向市民提供24小時核酸檢測服務(wù),爭取6小時出報(bào)告,對于現(xiàn)在新冠快速核酸檢測技術(shù),與趙院士一起探討了值得期待和進(jìn)一步開發(fā)的技術(shù)和應(yīng)用。

趙國屏院士以新冠為例,講到對于一個“好的”臨床檢驗(yàn)產(chǎn)品,有5個關(guān)鍵要求:


第一,就是要正確,不能“錯怪好人”,不能出現(xiàn)“假陽性;必須準(zhǔn)確,不能“張冠李戴”,專一性、特異性要好。第二一定要靈敏,也就是說不能“放過壞人”,不能出現(xiàn)假陰性。第三最好能夠“定量”。定量是確定檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要佐證。第四,要快速,簡便;第五成本要盡可能低。


胡必杰教授表示,趙院士提到的“不抓錯好人”、“不放過壞人”,同時定量,讓臨床醫(yī)生更加精準(zhǔn)地去辨別是感染的病原體還是污染的病原體,同時簡捷方便與價優(yōu),是非常重要的。如果一項(xiàng)分子診斷技術(shù)非常昂貴,很多病人享受不到,只有達(dá)到以上五點(diǎn)要求,這項(xiàng)技術(shù)才能廣泛應(yīng)用到臨床,最終讓老百姓和普通病人得益。

03

等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR診斷技術(shù)

的有機(jī)結(jié)合


而后趙院士提到,在過去幾十年的時間里,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了極大的發(fā)展,現(xiàn)有也已經(jīng)開發(fā)了很多種方法體系,包括經(jīng)典LAMP技術(shù)和RPA技術(shù)。等溫?cái)U(kuò)增有快速靈敏,對儀器要求低,是分子POCT診斷領(lǐng)域重要的技術(shù)力量。

第二項(xiàng)技術(shù)即是最近發(fā)展的CRISPR診斷技術(shù)。主流CRISPR診斷技術(shù)主要基于CRISPR-Cas12或Cas13來開發(fā),利用了Cas蛋白“反式切割活性”,可以將體系中的單鏈核酸高效的切割。


所以,CRISPR診斷的原理就是:當(dāng)待檢體系中存在靶標(biāo)核酸時,Cas蛋白在向?qū)NA的引導(dǎo)下特異識別靶標(biāo)序列,形成復(fù)合物,進(jìn)而被激發(fā)出針對切割單鏈核酸的“反式切割活性“,將體系中的熒光標(biāo)記探針切碎,發(fā)出熒光信號,完成檢測過程,通過檢測體系是否發(fā)光來判斷靶標(biāo)核酸是否存在。


將恒溫?cái)U(kuò)增和CRISPR診斷技術(shù)結(jié)合起來,既可以利用恒溫?cái)U(kuò)增的快,靈敏和簡便,又可以利用CRISPR的特異和靈敏,在進(jìn)行快檢的同時,既不用擔(dān)心檢測的假陽性和假陰性問題,也不用擔(dān)心PCR檢測中不確定的“灰區(qū)”問題。

對于伯杰利用由其實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的,吐露港公司授權(quán)的CRISPR診斷專利技術(shù),成功開發(fā)的國內(nèi)首款CRISPR快檢一體機(jī)BG-Nova-X8,院士對其速度和通量表示了贊賞,認(rèn)為儀器可以在30-40分鐘內(nèi)完成24個新冠標(biāo)本檢測,可以期待這個系統(tǒng)能夠?yàn)樾鹿诳鞕z多做貢獻(xiàn)。

趙院士提到,未來技術(shù)的展望,等溫?cái)U(kuò)增的特異性和靈敏度都需要進(jìn)一步提升,可以通過和別的技術(shù)結(jié)合,“取長補(bǔ)短”來提升檢測特異性和靈敏度,這一次伯杰將等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR技術(shù)的嘗試,就是邁出了可喜的一步。


等溫?cái)U(kuò)增的一管多重問題還需要創(chuàng)新的思路或者原理方面的突破,另一方面把恒溫?cái)U(kuò)增,CRISPR診斷技術(shù),和數(shù)字PCR技術(shù)的絕對定量原理結(jié)合起來,來實(shí)現(xiàn)絕對定量,在未來有更多發(fā)展的可能性。 

04
CRISPR技術(shù)的未來研究方向

可以說,CRISPR/Cas系統(tǒng)毫無疑問為感染性疾病的診斷提供了新的方法和契機(jī),總結(jié)來說,它具有如下優(yōu)點(diǎn):



相較于基于PCR的傳統(tǒng)方法,毫不遜色的靈敏度和特異度


檢測所需時間短


簡單便攜,不依賴昂貴的儀器和嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)環(huán)境


試劑耐受冷凍干燥,便于儲存和攜帶


標(biāo)本前處理可以非常簡單


結(jié)果讀取方便,能通過熒光或者肉眼讀取結(jié)果

這幾大優(yōu)點(diǎn)使得CRISPR檢測平臺可以對病原體核酸分子實(shí)現(xiàn)實(shí)時快速檢測。根據(jù)以上的分析,未來CRISPR技術(shù)的兩大研究方向也初見雛形:


第一,是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅長識別單鏈DNA,豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。


第二,是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺結(jié)合起來,開發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場效應(yīng)晶體管,以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上,從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開發(fā)出的CARMAN技術(shù),可以對數(shù)十個樣本,上百種病毒進(jìn)行快速檢測,為解決通量低的問題提供了方法等。


不斷地將新興的材料與技術(shù)與CRISPR技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ),開發(fā)出更實(shí)用新穎的檢測策略用于感染性疾病診斷,將是未來一段時間內(nèi)的研究重點(diǎn)。


關(guān)于伯杰醫(yī)療

上海伯杰醫(yī)療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應(yīng)用,深耕于多重?zé)晒釶CR診斷試劑和痕量病毒二代測序試劑及相關(guān)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線,從診斷試劑、診斷儀器、測序服務(wù)和醫(yī)檢所服務(wù)等多個面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng)新,質(zhì)量為先”的方針,為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控公衛(wèi)、高??蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。

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